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2023-07-13 16:00

流式细胞术（FCM）是利用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的生物颗粒进行多参数、快速定量分析；同时也可以对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞术在辅助生殖医学领域得到了大量应用，在判断免疫性不孕、预测精子受精能力等技术中发挥重要作用。

一、FCM检测不孕不育患者的免疫细胞表面标志物

1、检测T细胞亚群

调节性T细胞检测：

调节性T细胞（Treg细胞）通过对抗免疫反应中的自身抗体，在免疫系统自身耐受性的维护中发挥着主导作用。不明原因的不孕、流产常与Treg细胞的数量和功能相关。当妊娠期Treg细胞缺乏时，会导致母体排斥胎儿而引发妊娠终止。反复自然流产（RSA）的妇女外周血FCM检测，Treg细胞表达量减少，并且其抑制能力降低。故 Treg细胞有望成为胎儿母体免疫耐受与复发性流产以及不孕不育治疗的检测新靶点。

双阴性T淋巴细胞（CD3+CD4-CD8-T细胞，DNT细胞）:

具有下调自体和异体免疫反应、诱导免疫耐受和调节自身免疫等功能。Treg细胞一定程度的升高有利于妊娠的发生，而DNT细胞可以适当地抑制一些自身抗体对胚胎的免疫反应以起到保护胚胎的作用，但是反复流产可能导致DNT细胞异常升高，反而引起免疫调节功能异常。

2、检测自然杀伤(NK)细胞

NK细胞在女性的生殖功能中发挥重要作用，用FCM检测外周血NK细胞的表达，发现其升高可导致流产。外周血NK细胞的表达水平关系到胚胎移植的成功率，因为RSA或不孕是由于NK细胞的细胞毒性或受体/基因表达来决定。

有研究利用FCM检测反复种植失败患者，种植窗期人绒毛膜促性腺激素宫腔灌注后的CD56+CD16-和CD56+CD16+NK亚群细胞数量及百分比的变化，发现采用宫腔灌注HCG的方法能提高反复种植失败患者种植窗期子宫内膜局部CD56+CD16-NK数量及百分比，诱导免疫耐受、进而提高子宫内膜容受性，促进胚胎植入。

二、FCM在精子结构和功能检测中的应用

1、检测精子中的白细胞含量

白细胞是精液中常见的一种细胞。白细胞可通过吞噬作用、产生活性氧，分泌一些细胞因子等途径诱导细胞凋亡，导致精子数量减少。FCM检测是根据白细胞所表达的共同抗原，用结合荧光染料的单克隆抗体CD45标记白细胞进行检测，可准确区分白细胞与生精细胞，操作简便，结果可靠，且可进一步区分白细胞各亚群。

2、检测精子DNA完整性

精子DNA损伤是造成男性不育的一个重要因素，大量研究表明精子DNA损伤程度与受孕率及其胚胎质量呈负相关。

3、检测线粒体功能

精子线粒体膜电位（MMP）的高低与其运动能力有关，MMP的下降是精子凋亡早期的标志性事件。

用于检测MMP的荧光染料JC-1染色的特异性最好，与线粒体内膜结合后，只在线粒体膜崩解时才释放出来，检测结果可靠，敏感性高。在MMP较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中形成聚合物，可以产生橙红色荧光；在MMP较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。利用 JC-1单标法检测精子MMP，可以作为男性不育的辅助诊断指标。

研究发现，MMP降低可能是弱精子症的重要病因，联合检测MMP和精子DNA完整性对预测精子早期凋亡具有重要的应用价值。

中生流式实测图

4、检测精子获能与顶体反应

钙离子渗透途径参与调节精子活力、诱导精子超活化、精子的减数分裂等，精子胞内钙离子浓度的上升是精子激活的重要特征。顶体结构及功能与妊娠率显著相关。

钙内流被认为是正常顶体反应的起始事件。使用钙离子载体作为精子顶体反应诱发物，异硫氨酸荧光素（FITC）标记的花生凝集素（PNA）能特异性地标记在顶体膜上，其荧光强度可反映顶体大小，因此通过测定荧光强度可间接反映顶体结构的完整性。如果顶体内容物丢失，与PNA结合的活性降低或消失，FITC标记的荧光也会消失。

中生流式实测图