新闻中心

首页

2023-10-25 15:00

细胞周期 (cell cycle) 是指细胞从一次分裂完成到下一次分裂结束所经历的全部过程，包括分裂间期和分裂期(M期)，其中分裂间期又可分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)。G0期是静止期细胞，它们暂时脱离细胞周期，停止细胞分裂，但在一定条件的刺激下，又可重新进入细胞周期进行分裂(Cooper, 2000)。

一、实验原理

细胞是生命活动的基本单位，而细胞周期又与细胞的增殖和分化密切相关。因此，对于细胞周期的检测至关重要。细胞内的DNA含量会随细胞周期进程而发生周期性变化，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各阶段的百分比。常用于测定DNA含量的染料有碘化丙(PI)、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、7-氨基放线菌素(7-AAD)、Hoechst 33342、Hoechst 33258等。本文主要就其中两种常用染料PI(固定细胞染色)和Hoechst 33342 (活细胞染色) 的实验方法、注意事项和结果分析展开介绍。

二、材料与方法

1、荧光通道参数

2、实验试剂

3、样本类型

细胞

4、实验步骤

A. 固定细胞PI染色法

1. 收集2×10⁵细胞，200×g离心2分钟，去除上清，并用1 ml 1×PBS (不含Ca2+、Mg2+) 清洗一次。
2. 用0.5ml预冷的70%乙醇重悬固定细胞，在涡旋器上一滴一滴地加入乙醇，4°C固定30分钟以上。在醇类固定剂中-20°C下可以存放几个星期。
3. 200×g离心2分钟，去除乙醇，并用1ml 1×PBS清洗三次。

4. 用含50μg/mlPI和200μg/ml RNase的0.5ml 1×PBS重悬细胞， 37°C孵育30分钟。

5. 无需洗涤，样品过200目细胞过滤膜后转移至流式管。

6．上机检测。

B. 活细胞Hoechst 33342染色法

1. 收集2×10⁵细胞，200×g离心2分钟，去除上清，用1ml 1×PBS (不含Ca2+、Mg2+) 清洗一次。
2. 用含10μg/ml Hoechst 33342的PBS重悬细胞，37°C孵育30分钟。注：Hoechst最佳浓度和染色时间需要根据具体的每种细胞来确定，一般浓度在5~20μg/ml，孵育时间为30~120分钟。
3. 无需洗涤，样品过200目细胞过滤膜后转移至流式管，放置冰上。
4. 上机检测。

5、注意事项

1. 一定要做细胞计数，确保细胞数与固定剂量和染料的浓度相匹配。一般来说细胞浓度控制在2×10⁵~2×10⁶细胞/毫升。
2. 贴壁细胞的消化时间要控制好，消化时间过长，细胞易成团。可边消化边观察。
3. 如果细胞标记荧光蛋白或需要做表面标记，不能使用醇类固定剂，可以使用醛类固定剂。使用醛类固定剂时可以加 0.1% Triton X-100。
4. 醇类固定后的样品可以在-20°C存放几个星期，若短时间可置于4°C避光保存。
5. 上样速度不宜过快，细胞浓度不宜过高，一般低流速、200个细胞/秒为佳。